催化激活状态的酵母剪接体结构揭示RNA剪接分支反应的机理

文章作者:管理一号 | 2019-03-16
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来历:结构生物学高精尖立异中心

2019年3月15日,清华大学结构生物学高精尖立异中心施一公研讨组就剪接体的机理与结构研讨,于《细胞》(Cell)杂志宣布题为《催化激活状况的酵母剪接体结构提醒RNA剪接分支反响的机理》(Structures of the Catalytically Activated Yeast Spliceosome Reveal the Mechanism of Branching)的科研论文,提醒了剪接体榜首步剪接反响前的瞬变状况——催化激活剪接体(catalytically activated spliceosome,界说为“B*复合物”)4个不同构象的高分辩率三维结构,这是现在RNA剪接循环中终究一个未被解析的根本状况。至此,施一公研讨组成为世界上首个、也是仅有一个成功捕获并解析了RNA剪接进程中一切彻底拼装剪接体高分辩率三维结构系列效果的团队。该文报导的这4个同一状况却不同构象的剪接体结构,全体分辩率为2.9埃-3.8埃,中心区域的分辩率高达2.7埃,是现在报导的最高分辩率剪接体结构,该结构初次提醒了榜首步剪接反响发作进程中的动态改变,展现了剪接因子关于剪接反响发作的重要效果,榜首次从结构信息中答复了剪接体对不同pre-mRNA底物辨认的特异性等重要科学问题。

1977年,科学家们初次发现来自于腺病毒的mRNA与其对应的DNA转录模板并不能构成接连的杂交双链,而是在杂交双链的不同方位伸出了环状的DNA单链。这个严重发现标明,遗传信息从DNA传递到mRNA上并不仅仅经过转录,还需要pre-mRNA剪接来进一步完结“无效”遗传信息的去除与有用遗传信息的拼接。“无效”的遗传信息不具有翻译功用,被称为内含子,而能够被核糖体翻译的有用遗传信息叫做外显子,内含子被去除、外显子被衔接这一进程即为RNA剪接。RNA剪接遍及存在于真核生物中,跟着物种的进化,含有内含子的基因数量添加,发作RNA剪接的频率也相应增高,使得一个基因编码多个蛋白质成为可能,极大的丰厚了蛋白质组的多样性,也是真核生物多样性的重要原因之一。

RNA剪接是真核生物基因表达调控的重要环节之一,其化学实质是两步转酯反响。这种看似简略的化学反响在细胞中难以自行发作,而担任履行这一化学反响的是细胞核内一个巨大且高度动态改变的分子机器——剪接体(spliceosome)。从1977年初次发现RNA剪接至本世纪初,科学家们经过免疫沉淀、基因敲除、交联质谱、树立体外剪接反响体系等研讨手法,开始树立起剪接体的拼装、激活与解聚的发作进程,以及蛋白与蛋白、蛋白与核酸之间的彼此效果、彼此调控等杂乱的RNA剪接调控网络。在剪接反响进程中,多种蛋白-核酸复合物及剪接因子依照高度准确的次序发作结合、重排和解聚,顺次构成预拼装复合物U4/U6.U5 Tri-snRNP(U4/U6.U5三小核核糖核蛋白复合物)以及至少8个状况的彻底拼装剪接体pre-B、B、Bact、B*、C、C*、P以及ILS复合物(图1)。

图1  RNA剪接示意图(图片来历: Yan, C., Wan, R., & Shi, Y. (2019).Cold Spring Harbor perspectives in biology, 11(1), a032409.)

因为剪接体高度的动态性和杂乱性,取得不同状况的剪接体的高分辩率三维结构被公认为世界难题。在这种巨大的应战下,施一公教授带领研讨组知难而进,经过7年的尽力,总算在2015年初次报导了裂殖酵母剪接体3.6埃的高分辩率结构,初次展现了剪接体催化中心近原子分辩率的结构。这一严重研讨效果对RNA剪接机理的研讨发作革命性影响。自2015年榜首个剪接体结构宣布今后,施一公研讨组相继解析了酿酒酵母剪接体复合物处于8个不同状况的高分辩率结构,别离是3.8埃的预拼装复合物U4/U6.U5 Tri-snRNP、3.3埃-4.6埃的预催化剪接体前体pre-B complex、3.9埃的预催化剪接体B complex、3.5埃的激活状况剪接体Bact complex、3.4埃的榜首步催化反响后剪接体C complex、4.0埃的第二步催化激活剪接体C* complex、3.6埃的完结两步转酯反响后的剪接体P complex,以及3.5埃的内含子套索剪接体ILS complex的结构。这些已解析的剪接体根本覆盖了整个RNA剪接循环,从分子层面提醒了剪接体催化RNA剪接两步反响的作业机理,一起为了解剪接体的拼装、激活和解聚等进程的发作供给结构根据。但是,终究一个未被解析的彻底拼装剪接体B* complex,关于了解榜首步剪接反响的发作具有至关重要的效果。因为其高度的动态性与瞬时性,怎么捕获B* complex成为领域内的一大难题,也是世界上不同课题组抢先处理的问题之一,捕获并解析其结构火烧眉毛。

虽然之前积累了很多剪接体结构研讨的经历,施一公研讨组在针对怎么捕获安稳的B* complex时,却是寸步难行,困难重重。因为B* complex和C complex是榜首步剪接反响发作时一前一后的两个状况,领域内对其判定的中心差异在于5’剪接位点与分支点之间的磷酸二脂键是否构成。因而,在不影响剪接体正常拼装和激活的前提下,怎么阻挠榜首步反响发作,而且坚持5’剪接位点与分支点现已进入RNA剪接的活性反响中心,并构成反响前的活性位点,成为本文研讨的最大难点。施一公研讨组别离进行了体内内源直接阻断和体外树立剪接反响阻断等办法的测验,终究都无法取得安稳的B* complex样品。在最新宣布的这篇《细胞》文章中,施一公研讨组将体内阻断与体外树立剪接反响相结合,对提纯计划屡次探究,终究优化出一套能够取得安稳的、性质杰出的B* complex样品。为了探究剪接体对不同pre-mRNA底物的辨认特异性,施一公研讨组选取了领域内常用的两种pre-mRNA作为剪接体结合的底物,随后使用单颗粒冷冻电镜技能重构出了4个不同构象B* complex全体分辩率为2.9埃-3.8埃的冷冻电镜结构,并建立了原子模型,其间包含了4条RNA和35个蛋白(图2)。

图2 酿酒酵母催化激活剪接体4个构象的三维结构

该文解析的4个不同构象的B* complex结构,初次展现了RNA剪接榜首步反响发作进程平分支点怎么被剪接体逐渐“推入”活性反响中心的动态改变,其间榜首步剪接因子Yju2在安稳分支点中发挥了无足轻重的效果,虽然此刻5’剪接位点与分支点的间隔非常挨近(4.3埃),却不足以构成磷酸二脂键。然后,该结构也明晰地提醒了要害蛋白因子Cwc25在激起榜首步剪接反响中的重要效果(图3)。值得一提的是,在这个结构中,榜首次调查到了pre-mRNA平分支点A被5’剪接位点GU经过经典的碱基互补配对以及碱基堆积力一起辨认的机制,这个结构信息进一步证明了该位点在真核生物中高度保存的重要性。本文另一大亮点是初次提醒了剪接体对不同pre-mRNA底物辨认的特异性,为体内不同pre-mRNA的剪接功率存在差异供给了最直接的结构信息。

图3 酿酒酵母剪接体介导分支反响的模型

到现在,施一公研讨组在酵母中总共解析了10个不同状况的剪接体高分辩的三维结构(如图4),效果悉数宣布于世界尖端期刊《科学》和《细胞》(Science 7篇,Cell 3篇),从拼装到被激活,从发作两步转酯反响发作到剪接体的解聚,这10个状况的剪接体完好覆盖了剪接通路,初次将剪接体介导的RNA剪接进程完好的串联起来,为了解RNA剪接的分子机理供给了最明晰、最全面的结构信息。

图4 施一公研讨组解析的酵母剪接体结构汇总(图片来历: https://ygshi.org/research)

十年一剑!施一公试验室就剪接体结构研讨提醒RNA剪接分子机理

清华大学结构生物学高精尖立异中心主任施一公教授为本文的通讯作者;清华大学医学院博士后、高精尖立异中心杰出学者万蕊雪、生命学院四年级博士研讨生白蕊为该文的一起榜首作者,清华大学生命学院博士后、高精尖立异中心杰出学者闫创业为结构模型的建立供给了协助;清华大学冷冻电镜渠道主管雷建林博士为冷冻电镜数据搜集供给了协助。电镜数据收集于清华大学冷冻电镜渠道,核算作业得到清华大学高性能核算渠道、国家蛋白质设备试验技能中心(北京)的支撑。本作业取得了北京结构生物学高精尖立异中心(清华)及国家自然科学基金委的经费支撑。

原文链接

https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(19)30155-2

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http://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(17)30954-6

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