视觉中国 基因魔剪变身“搜索引擎+双链开关”

文章作者:管理一号 | 2019-01-21
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来历:科学大院

“分子确诊”听起来十分“巨大上”,其实咱们早已不生疏:

献血?血站采血之后要检测乙肝(HBV)、丙肝(HCV)和艾滋病(HIV)等病毒。

要生娃?抽点血来产前筛查(地中海贫血、血友病、耳聋基因检测等)和新生儿筛查。

想看有没有患癌危险?来做个肿瘤前期筛查吧,看你是不是有肿瘤易感基因。

这悉数都离不开分子确诊技能。

图片来历:视觉我国

核酸分子,是悉数生命方式最基本的遗传物质。分子确诊技能经过对核酸分子的快速准确判定,可以供给各类疾病的患病危险、病因和基因型等信息,然后为疾病的防备、监控和医治供给相应根据。

现在最为老练、运用最为广泛的分子确诊技能是聚合酶链式反响技能(PCR技能)。可是,因为该技能操作杂乱、仪器贵重、还触及多重变温进程,使得该技能在现场和家庭检测范畴的运用中受到了极大约束。

我国科学院深圳先进技能研讨院副研讨员周文华博士等运用CRISPR体系效应蛋白Cas9在与靶核酸分子结合进程中一起的构象改变,高效发动针对靶核酸分子的指数倍扩增(简称CRISDA技能),可在1小时左右将极低浓度的特征性靶核酸仿制至满意被检测到的浓度,并且无需经过任何变温进程。相关研讨成果已宣布在世界威望刊物《天然·通讯》 (Nature Communications)上,文章一起榜首作者为周文华副研讨员和胡丽研讨助理,通讯作者是喻学锋研讨员 (Nat.Commun。 2018, 9, 5012)。相关技能也已申请专利维护。

研讨成果以长文方式宣布于世界威望刊物《天然·通讯》杂志

PCR:循环变温是我的短板

PCR技能是一种在体外扩增DNA分子的技能,经过在待扩增的DNA片段两边规划两条寡核苷酸引物,经过多重循环后,完结靶DNA分子的指数倍扩增。

PCR进程示意图(图片来历:http://www.baike.com/wiki/%E8%81%9A%E5%90%88%E9%85%B6%E9%93%BE%E5%BC%8F%E5%8F%8D%E5%BA%94)

可是,因为PCR的每个循环进程包含了高温变性、低温退火和中温延伸三个温度不同的事情,对仪器的准确控温要求极高。市面上的PCR热循环仪价格遍及在数万至数十万元之间,若想要在家庭、社区或底层检测组织中完结遍及性运用仍是一大难题。

为了战胜PCR技能的缺点,一类不依靠变温的检测技能,即等温扩增技能得到了广泛重视。这些技能因为反响温度单一,不受热循环仪的限制,正逐步在特定范畴替代PCR。可是其时,等温扩增技能在体系杂乱程度、灵敏度、特异性和抗干扰才能等方面仍存在着缺点。更重要的是,现在一切老练的等温扩增检测技能的中心专利均把握在国外公司手中。

因而,开宣布一种功用优异、具有彻底自主知识产权的核酸等温扩增检测新技能,对满意我国分子确诊范畴日益增长的需求、进步相关工业的世界竞争力含义严重。

基因魔剪变身“搜索引擎+双链开关”

大名鼎鼎的CRISPR/Cas9体系被称为“基因魔剪”,在基因调控和基因修改等范畴运用广泛,该体系的效应蛋白(Cas9蛋白)可以辨认特定基因序列,并对辨认靶点邻近的 DNA 双链进行剪切。

CRISPR/Cas9技能机理示意图。一段与靶核酸序列互补的sgRNA(引导RNA)分子与CRISPR的效应蛋白Cas9构成Cas9-sgRNA复合体后,可在杂乱条件下自主寻觅靶核酸分子,并一步完结特异性结合与切开。(图片来历:研讨团队)

早在2015年头,当世界上绝大多数课题组都将精力和资源投入到CRISPR基因医治范畴时,该团队就首要意识到CRISPR体系在分子确诊范畴将有巨大的运用远景和优势:该技能操作简洁、灵敏度高、抗干扰性强。“可以说,其时咱们是在世界范围内最早提出这一想象的课题组之一。”周文华说。

经过三年不断的尽力,榜首代CRISDA技能已逐步老练。

在CRISDA反响中,Cas9蛋白就像一个具有自动搜索功用的“开关”,在找到具有某一疾病或某一特征相关的特定靶DNA序列后,能高效开始该靶核酸的指数倍“仿制”进程。整个反响进程可在从室温到45度的条件下高效进行,对温度要求极低。

试验进程中,Cas9-sgRNA复合体在杂乱溶液条件下自动搜索靶核酸分子并与之结合切开,切开后的靶DNA分子被解旋并暴露出单链区域,扩增引物进一步与该区域结合构成后续扩增反响的“开关”结构。这一结构在扩增酶类的效果下,开始靶核酸分子的指数倍链替代扩增反响。

CRISDA技能效果机理简图。(图片来历:研讨团队)

“在实践运用范畴,对特定序列的核酸进行检测的难度在于怎么对极低浓度的靶核酸分子进行特异性高效扩增。而对特异性扩增后的产品的检测,现在市场已有多种老练的手法,并不是技能难点。”周文华介绍说。

 

可是,课题组将CRISPR体系作为核酸等温扩增反响的开关,并运用于分子确诊范畴的研讨尚属初次。一起,CRISDA技能背面原理十分杂乱,为了完结这一基因快检技能,团队在研制进程中也阅历了多重检测。“可以说咱们其时是在一个彻底不知道的范畴探究,每个技能细节都是靠咱们不断的测验和优化来完结的。” 周文华说到。

CRISDA:四大优势

现在,研讨团队已经过两步反响,在90分钟内,对极微量(20 μL)杂乱溶液样品中的个位拷贝数的靶核酸分子成功完结了等温扩增检测,如人基因组片段、乳腺癌致病危险相关的骤变位点或转基因大豆基因组等。CRISDA技能在这一极微量体积和极低浓度下的优异功用,可彻底满意现在分子确诊中,针对循环肿瘤DNA(ctDNA)和循环游离胎儿DNA(cffDNA)等检测的需求。

运用CRISDA技能对aM量级的靶分子进行单核苷酸多态性(SNP)扩增检测。(a)不同细胞株基因组中rs3803662位点的测序验证;(b)运用CRISDA技能对该SNP位点进行高灵敏度扩增检测。(图片来历:论文)

CRISDA技能在诸多方面均优于传统PCR技能,

首要,在灵敏度方面,因为CRISDA技能与传统PCR技能比较具有更优异的抗干扰性,其可在杂乱布景条件下,对aM(10-18M)浓度的靶核酸分子进行高效扩增检测。而在相同条件下,PCR技能因为抗干扰才能较差,无法完结有用扩增。

其次,在特异性方面,CRISDA技能无需优化即可完结对极低浓度的靶核酸分子进行单核苷酸多态性(SNP)检测。而PCR技能要完结SNP检测则需经过联合测序、酶反响或许多重引物等条件来完结,其本钱和杂乱程度无法满意快速分子确诊的需求。

第三,在普适性方面,在CRISDA检测反响中,所需的扩增引物规划简略,无需优化即可敏捷完结对新位点的检测反响体系开发。而PCR反响或其他等温扩增反响则需经过很多优化。现在,课题组已运用该技能成功检测出人基因组中乳腺癌相关的单核苷酸位点骤变,并在野生型大豆中成功检测出万分之三的转基因大豆。

第四,在操作难度方面,CRISDA技能无需依靠仪器,仅经过简略操作,即可在90分钟内即可完结从富集到扩增检测的悉数进程。且整个进程对温度依靠极低。而传统的PCR技能则需依靠多步繁琐操作,进程耗时4小时,且对仪器控温要求极高。

传统PCR技能与CRISDA检测技能比照(图片来历:研讨团队)

此外, CRISDA技能可与一步法CRISPR靶向核酸富集技能完美结合,在进一步进步CRISDA检测功用的根底上,处理了核酸提取这一困扰分子确诊范畴的技能痛点。例如,运用该一步法CRISPR靶向核酸富集技能,可完结对杂乱样品中的靶核酸分子特异性提取,可极大地缩短血筛检测样品前处理的难度和杂乱程度。一起,这一技能也为未来CRISDA技能在底层和家庭推行奠定了根底。

未来:在家就能做确诊……

近期,周文华等提出的以该技能为布景的“根据CRISPR-Cas体系的核酸高敏快速等温检测技能”项目在中科院首届“首要杯”未来技能创新大赛中,从近千个项目中锋芒毕露,取得终究决赛优胜奖。“你们的技能主意十分独特,很好地运用了CRISPR技能的特色,并展现了该技能比较于传统PCR技能的优势。我信任这一技能未来在核酸分子检测范畴将有着十分重要的含义。”大赛评委点评中说到。

现在,团队也正在活跃和分子确诊职业的龙头企业展开深化协作,将该技能运用于突发或新式流行症的检测,如新式流感,非洲猪瘟等。

未来,团队计划根据CRISDA技能,开宣布手刺巨细的一次性微流控生物芯片,服务于遗传病筛查、流行病确诊、食品安全和公共安全等范畴,充沛满意从现场检测到家庭检测的市场需求。

“咱们想象未来仅需极少量的生物样本,运用CRISDA的生物芯片就能在家零门槛检测白叟或儿童患的是一般伤风仍是新式病毒性流感。”周文华想象道,“一起,CRISDA家庭检测仪所取得的成果将实时上传到家庭所注册的社康中心,家庭医生将结合检测成果和最近从社区到区域的流行病危险改变敏捷给出最有用的医治计划。咱们期望这悉数都能在家庭完结,然后进步患者的治疗功率,防止到医院就诊进程中的穿插感染,并削减三甲医院的压力,充沛发挥底层社康中心的分级才能。”

CRISDA检测体系原理(图片来历:研讨团队)

该团队的研讨展现了根据CRISPR-Cas9的核酸等温检测技能在医疗确诊和食品安全范畴巨大的运用远景,一起也为其他具有相似特性的体系或蛋白在运用上供给了新思路和办法。这一系列研讨将有或许推进分子确诊技能和产品从现在的专业组织延伸至底层甚至家庭。

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